Pregabalīns nav GABAA vai GABAB receptoru agonists.
Pregabalīns ir gabapentinoīds un darbojas, inhibējot noteiktus kalcija kanālus.Konkrēti, tas ir noteiktu no sprieguma atkarīgu kalcija kanālu (VDCC) papildu α2δ apakšvienības vietas ligands un tādējādi darbojas kā α2δ apakšvienību saturošu VDCC inhibitors.Ir divas zāles saistošas ​​α2δ apakšvienības, α2δ-1 un α2δ-2, un pregabalīnam ir līdzīga afinitāte (un līdz ar to arī selektivitātes trūkums starp) šīm divām vietām.Pregabalīns selektīvi saistās ar α2δ VDCC apakšvienību.Neskatoties uz to, ka pregabalīns ir GABA analogs, tas nesaistās ar GABA receptoriem, nepārvēršas par GABA vai citu GABA receptoru agonistu in vivo un tieši nemodulē GABA transportu vai metabolismu.Tomēr ir konstatēts, ka pregabalīns izraisa no devas atkarīgu L-glutamīnskābes dekarboksilāzes (GAD) smadzeņu ekspresijas palielināšanos, kas ir enzīms, kas atbild par GABA sintezēšanu, un tādējādi tam var būt netieša GABAerģiska iedarbība, palielinot GABA līmeni smadzenēs.Pašlaik nav pierādījumu, ka pregabalīna iedarbību ietekmētu kāds cits mehānisms, izņemot α2δ saturošu VDCC inhibīciju.Atbilstoši šķiet, ka α2δ-1 saturošu VDCC inhibīcija ar pregabalīnu ir atbildīga par tā pretkrampju, pretsāpju un anksiolītisko iedarbību.
Endogēnās α-aminoskābes L-leicīns un L-izoleicīns, kas pēc ķīmiskās struktūras ļoti atgādina pregabalīnu un citus gabapentinoīdus, ir šķietami α2δ VDCC apakšvienības ligandi ar līdzīgu afinitāti kā gabapentinoīdiem (piemēram, IC50 = 71 nM L- izoleicīns), un tie atrodas cilvēka cerebrospinālajā šķidrumā mikromolārā koncentrācijā (piemēram, 12,9 μM L-leicīnam, 4,8 μM L-izoleicīnam).Ir teorija, ka tie var būt apakšvienības endogēnie ligandi un ka tie var konkurētspējīgi antagonizēt gabapentinoīdu iedarbību.Atbilstoši tam, lai gan gabapentinoīdiem, piemēram, pregabalīnam un gabapentīnam, ir nanomolāra afinitāte pret α2δ apakšvienību, to spēja in vivo ir zemā mikromolārā diapazonā, un ir teikts, ka konkurence par saistīšanos ar endogēnām L-aminoskābēm ir atbildīga par šo neatbilstību.

Vienā pētījumā tika konstatēts, ka pregabalīnam ir 6 reizes lielāka afinitāte nekā gabapentīnam pret α2δ apakšvienību saturošiem VDCC.Tomēr citā pētījumā tika atklāts, ka pregabalīnam un gabapentīnam bija līdzīga afinitāte pret cilvēka rekombinanto α2δ-1 apakšvienību (Ki = 32 nM un 40 nM, attiecīgi).Jebkurā gadījumā pregabalīns ir 2 līdz 4 reizes spēcīgāks nekā gabapentīns kā pretsāpju līdzeklis, un šķiet, ka dzīvniekiem tas ir 3 līdz 10 reizes spēcīgāks nekā gabapentīns kā pretkrampju līdzeklis.